W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat nasze zrozumienie ludzkiego genomu wzrosło wykładniczo, wraz z szybkim rozwojem baz danych sekwencji i narzędzi bioinformatycznych. A presja, by produkować więcej, szybciej i taniej sekwencji DNA, stała się kluczowa dla badań naukowych. W pierwszej dekadzie dwudziestego pierwszego wieku postępy w technikach mikromacierzy pozwoliły naukowcom i badaczom na analizę ludzkiego genomu z coraz większą rozdzielczością. Konwencjonalne techniki mają swoje ograniczenia, które wymagają opracowania nowych metod eksperymentalnych. Metoda sekwencjonowania Sangera, która wciąż jest uważana za złoty standard sekwencjonowania, ma swoje ograniczenia. Dzięki możliwości sekwencjonowania ponad miliona fragmentów DNA jednocześnie, sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) zrewolucjonizowało zdolność do generowania dużych ilości danych sekwencyjnych przy niezwykle niskich kosztach.

Czym jest sekwencjonowanie całego genomu?

Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) to kompleksowa metoda analizy całej sekwencji genomowego DNA komórki w jednym czasie. WGS to technologia, która umożliwia naukowcom odczytanie dokładnej sekwencji wszystkich liter składających się na kompletny zestaw DNA. Ludzki genom jest wciąż słabo poznany i nawet najlepiej zbadana jego część stanowi około 3% genomu, który koduje białka. A funkcje białek w ludzkim genomie są również częściowo poznane. Z tych powodów analiza obliczeniowa danych sekwencji genomowych ma na celu identyfikację znaczenia medycznego wszystkich funkcjonalnych elementów genomu oraz identyfikację funkcji genów i ich udziału w chorobach. Oczekuje się, że WGS z wykorzystaniem technologii NGS zrewolucjonizuje opiekę kliniczną, jednak ogólna obietnica sekwencjonowania całego genomu jest daleka od spełnienia. WGS polega na sekwencjonowaniu całego genomu w celu badania mutacji i rearanżacji.





Czym jest sekwencjonowanie następnej generacji?

Nie ma precyzyjnej definicji sekwencjonowania następnej generacji (NGS), ale istnieje kilka cech, które wyraźnie odróżniają platformy NGS od konwencjonalnego sekwencjonowania opartego na kapilarach. Sekwencjonowanie następnej generacji, znane również jako masywnie równoległe sekwencjonowanie, jest stosunkowo nową techniką, która umożliwia sekwencjonowanie cząsteczki DNA o całkowitym rozmiarze znacznie przekraczającym 1 milion par zasad w pojedynczym eksperymencie. NGS jest potężną platformą, która zrewolucjonizowała dziedzinę nauk biologicznych, wykazując zdolność do sekwencjonowania DNA z niespotykaną dotąd prędkością i oferując opcję wysokiej przepustowości, pozwalającą na sekwencjonowanie wielu osobników w tym samym czasie. Osiąga się to dzięki miniaturyzacji objętości poszczególnych reakcji sekwencjonowania, co ogranicza wielkość instrumentów i minimalizuje koszt odczynników na jedną reakcję. NGS znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach, w tym w sekwencjonowaniu genomu de novo, resekwencjonowaniu całego genomu, analizie transkryptomu, ukierunkowanym resekwencjonowaniu, sekwencjonowaniu małych RNA i miRNA, sekwencjonowaniu całego egzomu itp.

Różnica między sekwencjonowaniem całego genomu a sekwencjonowaniem następnej generacji

Technologia



– Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) to kompleksowa metoda analizy całej sekwencji genomowego DNA komórki w jednym czasie. Technologia ta umożliwia naukowcom odczytanie dokładnej sekwencji wszystkich liter, które składają się na Twój kompletny zestaw DNA. Sekwencjonowanie następnej generacji, znane również jako masowo równoległe sekwencjonowanie jest stosunkowo nową techniką, która pozwala na sekwencjonowanie cząsteczki DNA o całkowitym rozmiarze znacznie większym niż 1 milion par zasad w jednym eksperymencie. Ideą jest generowanie dużych ilości danych o sekwencji DNA poprzez masową równoległość.

Proces

– WGS jest procedurą laboratoryjną, która identyfikuje kolejność zasad w genomie w jednym procesie. Aby to zrobić, pobiera się próbkę krwi lub śliny i wysyła do laboratorium, gdzie maszyna rozbija DNA i odczytuje litery jak kod. Naukowcy porównują następnie sekwencję Twojego DNA ze standaryzowaną referencją i identyfikują różnice pomiędzy dwoma zestawami liter, co prowadzi do identyfikacji wielu różnych rodzajów informacji osobistych. Zasada działania NGS jest podobna do tradycyjnej metody elektroforezy kapilarnej, która obejmuje trzy podstawowe etapy: Fragmentacja DNA, sekwencjonowanie bibliotek oraz analiza danych.



Aplikacje

– Sekwencjonowanie całego genomu polega na sekwencjonowaniu całego genomu w celu badania mutacji i rearanżacji. Dzięki sekwencjonowaniu całego genomu można składać genomy de novo, porównywać genom organizmu z genomem referencyjnym, identyfikować nowe zespoły genomów, śledzić epidemie patogenów, ewolucję molekularną, diagnozować podejrzane zespoły mendlowskie i nowotwory oraz wiele innych. Technologie NGS są wykorzystywane do sekwencjonowania całego genomu, epigenetyki, analizy transkryptomu, sekwencjonowania genomu de novo, wielkoskalowej analizy metylacji DNA, odkrywania niekodujących RNA i miejsc wiążących białka, identyfikacji biomarkerów dla wczesnej diagnostyki i wielu innych.

Podsumowanie sekwencjonowania następnej generacji vs. sekwencjonowanie całego genomu

Nie ma jednoznacznej definicji sekwencjonowania następnej generacji (NGS), ale istnieje kilka cech, które wyraźnie odróżniają platformy NGS od konwencjonalnych metod sekwencjonowania DNA, takich jak popularna już metoda Sangera, która przez wielu nadal jest uważana za złoty standard sekwencjonowania DNA. Technologie NGS są rutynowo stosowane we współczesnych badaniach molekularnych i stanowią potężne narzędzie w wielu zastosowaniach klinicznych. Jest to doskonała platforma diagnostyczna, ponieważ daje możliwość kompleksowego wykrywania mutacji w wielu celach genomowych jednocześnie, wysokoprzepustowej analizy paneli pacjentów w loci chorobowych oraz odkrywania niekodujących RNA i miejsc wiążących białka.